原理簡(jiǎn)介
GFP、RFP等熒光蛋白因其的熒光性質(zhì)和靈敏性，常作為報(bào)告基因研究并分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位和相互作用等。將目標(biāo)蛋白與熒光蛋白的N端或者C端融合，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)或穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，使得該融合蛋白在受體材料細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，目標(biāo)蛋白會(huì)牽引熒光蛋白一起定位到目標(biāo)細(xì)胞器，通過(guò)顯微鏡觀察熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)顯示的位置，確定目標(biāo)蛋白的位置，從而確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。
亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離定位法
通過(guò)離心等技術(shù)分離各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后從分離物種進(jìn)一步提取蛋白質(zhì)，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析或檢測(cè)，從而獲得目標(biāo)蛋白的定位。本方法適合研究某蛋白質(zhì)組級(jí)別的細(xì)胞器定位，通常與雙向凝膠電泳分離和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合。
生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
通過(guò)生物信息學(xué)手段，借助一些在線工具對(duì)蛋白的亞細(xì)胞定位信息進(jìn)行預(yù)測(cè)，這種方法可以在短時(shí)間獲得大量蛋白的預(yù)測(cè)信息，不僅輔助于實(shí)驗(yàn)，還能省時(shí)省力節(jié)約成本。
洋蔥亞細(xì)胞定位的方法包括但不限于以下三種：
熒光法：利用抗原與的特異性結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光標(biāo)記，從而確定細(xì)胞內(nèi)抗原的分布位置。
GFP融合蛋白表達(dá)法：將目的蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)融合，通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)位置。
亞細(xì)胞分離法：通過(guò)一定的物理或化學(xué)方法，將細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后通過(guò)離心、密度梯度離心等方法將細(xì)胞器分離出來(lái)，再對(duì)分離出來(lái)的各個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析。
雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)是一種在生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)利用熒光標(biāo)記的兩個(gè)分子，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，檢測(cè)兩個(gè)分子之間的相互作用。下面將詳細(xì)介紹雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的原理、實(shí)驗(yàn)步驟、應(yīng)用和發(fā)展趨勢(shì)。
雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的原理
雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理的。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)在一個(gè)緊密的空間內(nèi)相互靠近時(shí)，一個(gè)熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光能量會(huì)被另一個(gè)基團(tuán)吸收，導(dǎo)致第二個(gè)基團(tuán)也發(fā)射熒光。這種熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象稱(chēng)為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移效率，可以推斷出兩個(gè)分子之間的距離和相互作用情況。
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